Рис. 2. РК меняет активность щелочной фосфатазы и синтез протеогликанов. Хондроциты, взятые из большеберцовой кости, выращивали в течение 1 недели на частичках MBCP: а) в течение следующих 2 недель к питательной среде еженедельно добавляли РК; б) в группе контроля (а) в среду добавляли растворитель. Снимки частичек хондроцитов/MBCP получили после окраски в красный (для визуализации активности ЩФ) и синий (проявление уровня протеогликанов) цвет. Начальная плотность слоя клеток была одинаковой для экспериментальной и контрольной групп. Цветные фото можно просмотреть онлайн на www.lieberpub.com

 

Результаты

Прикрепление и пролиферация хондроцитов

СЭМ подтвердила, что хондроциты прикрепляются и пролиферируют на каркасе из МBCP (рис. 1). По завершении 1 недели хондроциты сформировали практически сплошной слой на поверхности каркаса. В течение следующих 2 недель слой стал ещё более плотным. В конце 3 недели можно было наблюдать сплошной слой полигональных хондроцитов, полностью покрывавший каркас и его поры. (рис. 1в).

Созревание хондроцитов

Применение ретиноловой кислоты привело к заметному повышению активности щелочной фосфатазы, что подтверждается глубокой красной окраской (рис. 2б, частички слева). Увеличение количества протеогликана в экстрацеллюлярном матриксе подтверждает интенсивная синяя фосфатазы также были измерены спектрофотометрически. При наличии окраски (рис. 2б, частички справа). Равные активности щелочной ретиноловой кислоты наблюдали значительное повышение фермент-ативной активности щелочной фосфатазы, что непосредственно зависело от продолжительности действия РК (рис. 3). Через 3 недели отличия между хондроцитами, на которые воздействовали и не воздействовали РК, были очевидными. При отсутствии РК клетки прикреплялись и пролиферировали в частичках MBCP®, полностью покрывая за 3 недели поверхность каркаса и его опоры (рис. 4а). Анализ СЭМ подтвердил наличие беспрерывного слоя плоских, полигональных хондроцитов на поверхности MBCP® (рис. 5а). Добавление РК в питательную среду культур приводило к отложению заметно более толстого экстрацелюлярного матрикса на поверхности частичек (рис. 4б). Изменения, вызванные добавлением РК, также были заметны на СЭМ. Рисунок 5б подтверждает, что зрелый экстрацеллюлярный матрикс полностью покрывает поверхности частичек и даже частично закрывает поры (стрелки на рис. 5б). Хондроциты окружены большим количеством волокон, образующих сложную сетку (рис. 5в). Чтобы охарактеризовать профиль экспрессии генов хондроцитов, выращенных на частичках MBCP®, на изолированной из 3-недельной культуры клеток мРНК было проведено ПЛР-ЗТ. Добавление РК в экспериментальной группе значительно увеличивало транскрипцию коллагена І типа и щелочной фосфатазы по сравнению с группой контроля. При этом увеличение транскрипции сbf1 было не таким большим (рис. 6). В то же время, уровни мРНК коллагена ІІ типа и Х типа уменьшалась при добавлении РК (рис. 6).

 

Обсуждение

Попытки создать каркас для in vitro хряща предпринимали с целью дальнейшего использования в заместительной терапии суставных хрящей [17]. В нашем исследовании мы предлагаем создать in vitro каркас кальцифицированного хряща как материала с потенциалом роста, для замены кости. Частички MBCP® и ранее использовались как каркас для формирования кости, но клетками-пердшественниками в таких случаях выступали остеобласты [11, 18]. В то время как материалы из кальций фосфата, такие как гидроксиапатит или β-трикальций фосфат, характеризуют в основном как остеокондуктивные, но не остеоиндуктивные [19, 20], имеются данные [4, 21, 22], что некоторые пористые гидрок-сиапатиты имеют остеоиндуктивные свойства благодаря своей пористости, которая делает возможным прикрепление эндогенных костных морфогенетических протеинов (ВМР). Кроме того, макро-пористость MBCP® находится в пределах оптимальных размеров (200-400 мкм) для носителей ВМР, чтобы последние могли начать прямое формирование кости [21, 22]. Кроме того, состав MBCP и лучшая растворимость β-трикальций фосфата, чем гидроксиапатита, может также способствовать остеогенезу [23, 24]. Мы выбрали MBCP® в качестве каркаса для энхондрального формирования кости, руководствуясь данными этих и иных исследований, подтверждающих, что такие материалы способствуют прорастанию остеобластов [11, 18] и остеокластической резорбции [25].

Рис. 5. СЭМ созревающих на MBCP хондроцитов. Хондроциты выращивали в течение 1 недели, следующие 2 недели к питательной среде добавляли или не добавляли РК. В конце 3 недели образцы фиксировали, обезвоживали, напыляли слой золота, анализировали в СЭМ и фотографировали. При отсутствии РК (а) хондроциты формировали тонкий слой клеток полигональной формы. Клетки, которые выращивались с добавлением 100 nM РК (б, в), продуцировали матрикс, богатый на волокна (стрелки на в), который иногда даже закрывал поры в каркасе (стрелки на б)

Наше исследование показало, что хондроциты могут прикрепляться и пролиферировать на частичках MBCP. Чтобы определить, способны ли хондроциты, выращенные на поверхности минерала созревать, мы воздействовали на клетки РК. Добавление РК привело к увеличению экспрессии гена ЩФ и её ферментативной активности, что, согласно другим исследования [16], является важным маркером созревания. К тому же, мы наблюдали увеличение количества сbf1, которое является положительным регулятором дифференциации как остеобластов, так и хондроцитов [26, 27]. Следует отметить также то, что добавление РК уменьшало экспрессию коллагенов ІІ и Х типов и увеличивало экспремию коллагена І типа. Ранее сообщалось о том, что экспрессия генов хондроцитов эпифизарной пластины характеризуется остеобластным фенотипом [28].

Данные исследований in vivo и in vitro подтверждают, что гипертрофированные хондроциты могут дифференцироваться и далее, и выделять маркеры костных клеток [29, 30], отмечая роль хондроцитов на начальных стадиях формирования кости. По известным нам данным, мы первые сообщаем о хондроцитах, выращенных на каркасе MBCP. Ранее в исследованиях сообщали, что хондроциты суставного хряща могут прикрепляться и пролиферировать на коллагеновой губке с добавление кристаллов кальций фосфата для повышения стабильности [31], однако тогда не указывался тип хондроцитов. Другое исследование подтвердило, что хондроциты, взятые из гребня подвздошной кости кролика, выращенные на блоках гидроксиапатита, и имплантированные в костные дефекты, способствовали значительно большему увеличению отложения костной ткани, чем тогда, когда подсаживались блоки только гидроксиапатита [32]. В отличие от хондроцитов суставного хряща, наши хондроциты были забраны из эпифизарной пластины и имеют потенциал к гипертрофии и концевой дифференциации, могут модифицировать каркас и создавать, таким образом, улучшенный остеоиндуктивный материал. Даже больше, гипертрофированные клетки способны продуцировать сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), который запускает механизм реваскуляризации, необходимый для энхондрального формирования кости [9, 10]. В самом деле, когда хондроциты суставного хряща мешаные с остеобластами свода черепа, помещенные в альгинат, были имплантированы иммунодефицитной мыши, у последней наблюдалось энхондральное формирование кости.

Одновременно трансплантированные клетки развились каждая в свой тип тканей (хрящ, костно-хрящевые соединения, кость) и начали стимулировать развитие кости [33]. В то время как все эти эксперименты допускали, что клетки выделяют факторы роста/дифференциации, которые влияют на пространственное строение и активность друг друга, Gerstenfeld и соавт. подтвердил, что гипертрофированные хондроциты выделяют растворимые элементы, которые селективно способствуют остеогенезу [34]. Если целью сегодняшних исследований является выявление этих факторов и установление механизмов их действия, наш подход - представление источника факторов дифференциации, имеет большой потенциал. Наша основная задача - создать промежуточный каркас для энхондрального формирования кости с потенциалом роста.